细胞生物学方法

细胞生物学目前已经不再局限于单个基因/蛋白/细胞器的研究，而是利用系统的研究方法对基因/蛋白/细胞器网络进行研究。

细胞形态结构的观测方法

1. 光学显微镜：照明系统采用可见光，使用玻璃透镜，可直接通过目镜观察镜像
   1. 普通光学显微镜
      • 细胞染色常用伊红-苏母金
   2. 相差显微镜（phase-contrast microscope）
      • 作用：把透过标本的可见光的光程差和相位差，通过光的干涉转变成振幅差，从而提高了细胞不同密度的区域的对比度，使各种结构变得清晰可见。常用来观察未染色的细胞切片（相位板放置正确后细胞整体偏暗，轮廓偏亮）
   3. 微分干涉显微镜（differential interference microscope）
      • 利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明暗效果，能显示结构的三维立体投影。标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。更适合研究活细胞。
   4. 荧光显微镜技术（fluorescence microscope）
      • 光源为短波光(高压汞灯或氙灯)；有两个特殊的滤光片(激发滤片、阻断滤片)细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射也可发荧光。荧光显微镜对这类物质进行定性或定量研究。灵敏度高，主要用于细胞结构和化学成分等的研究
   5. 激光共焦扫描显微镜技术（laser scanning confocal microscope）
      • 用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描；能显示细胞样品的立体结构；分辨率是普通光学显微镜的3倍；比荧光显微镜提高1.4-1.7倍。
      • 
   6. 荧光共振能量转移技术（fluorescence resonance energy transfer, FRET）
      • 双光子成像？
      • 依赖于两个蛋白相互靠近

   7. 全内反射荧光成像（total internal reflection fluorescence microscope, TIRF）

2. 电子显微镜：照明系统采用电子束，通过光电转换设备观察样品的镜像。
   • 电镜三维重构
   • 低温电镜技术
   • 超薄切片技术

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  1. 扫描电子显微镜（SEM）
     1. 主要得到细胞表面的形态结构
  2. 透射电子显微镜（TEM）
     1. 主要得到细胞内部结构

细胞及其组分的分析方法

1. 离心技术：是分离细胞器及各种大分子基本手段
   • 高速离心机：转速10~25kr/min
   • 超速离心机：转速>25kr/min（最高转速可达100000r/min）

• 差速离心：可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。
  • 特点：介质密度均一；速度由低向高，逐级离心。
  • 常用来分离大小相差悬殊的细胞器或细胞
  • 沉降顺序：核——线粒体——溶酶体与过氧化物酶体——内质网与高 尔基体——核糖体。
• 密度梯度离心：
  • 原理：将要分离的细胞组分小心地铺放在含有逐渐增加的、高溶解性的惰性物质形成的密度梯度溶液表面，通过重力或离心力的作用使样品中不同组分以不同的沉降率沉降，形成不同的沉降带。各组分的沉降率与他们的形状和大小相关，通常以沉降系数（S值）表示。
  • 常用介质：氯化铯、蔗糖。

2. 免疫细胞化学
   • 根据免疫学原理，利用抗体同特异性抗原专一结合，对抗原进行定位测定的技术。
   • 抗原主要为大分子或与大分子结合的小分子；抗体则是由浆细胞针对特异的抗原分泌的γ球蛋白。如果将抗体结合上标记物，再与组织中的抗原发生反应，即可在光镜或电镜下显示出该抗原存在于组织中的部位。
   • 胶体金技术： 其中ProteinA 来自金黄色葡萄球菌能与抗体的Fc domain结合。金原子较重，在电镜下能够较为清晰的显示。
   • 除了胶体金技术还有：
     • 荧光素─免疫荧光技术（常用荧光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明）
     • 酶─酶标抗体法（常用的酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶）
     • 放射性同位素标记—放射自显影
     • 铁蛋白标记
3. 分子杂交技术
   • 
4. 流式细胞仪
   
   • 特点：单个细胞随液流高速运动
   • 主要应用：
     • 用于定量测定细胞中 的DNA、RNA或某些特定蛋白的含量；
     • 测定细胞群体中具有特定性质细胞的数量；
     • 从细胞群体中分离特异染色的细胞。
     • 在免疫学中用于筛选细胞，十分重要！

细胞培养与细胞工程

植物细胞一般培养原生质体，但是难度较高，本课程一般不讨论。
疏水的蛋白（酯化修饰的蛋白）跑的快。

PCR：。。。
色谱：。。。
质谱：。。。
基因编辑/模式生物：。。。
组织特异性敲除：cre-loxP系统