核酸分子杂交技术

应用：

1. 研究DNA分子中某一种基因的位置
2. 监定两种核酸分子间的序列相似性，测定不同DNA分子的亲缘关系
3. 分离蛋白质的基因, 研究基因的转录和调节控制
4. 检测某些专一序列在待检样品中存在与否
5. 诊断一些遗传性疾病和肿瘤

DNA 印迹

又称为Southern Blot，主要使用电泳迁移系统。类似的还有RNA印迹，被称为Northern Blot。

DNA重组

DNA 克隆技术

切割与连接、细胞转化、核酸序列分析、基因人工合成、表达、定点突变、PCR扩增

克隆：将目的基因的片段插入到有复制能力的载体上。

限制性内切酶：
限制性: 有识别片段的限制，保护自身的DNA
内切酶：核酸内切酶在特定的内部位点切割 DNA，而核酸外切酶则从 DNA 或 RNA 分子的末端去除核苷酸
通常是古菌和细菌的免疫系统，用于降解外源的DNA. 第一个发现的核酸内切酶是EcoRⅠ，从大肠杆菌中发现。

平末端 blunt end/粘性末端 sticky end（回文结构基础）
其中粘性末端可以为3‘也可以为5’，依据酶不同而不同。

一共有四类内切酶，通常用第二类：
特点：

1. 较为简单，较小
2. 需要$\mathrm{Mg}{\phantom{A}}^{2+}$激活，没有甲基化酶活性和ATP酶的活性
3. 识别4-6个bp的回文序列

同尾酶：粘性末端相同（概率较小）

通常用同一种酶切割目的基因的两端。

碱性磷酸酶防止载体自连

载体：

克隆载体：质粒，噬菌体，粘性粒等，基本功能是自我复制
表达载体：要有启动子
穿梭载体：可以在同种宿主内增殖

标签：可以在N端也可以在C端，尽量短小，不要影响表达蛋白的性质和结构
原核生物可以多个基因共有一个启动子和终止子（效果不佳）

筛选：$\beta$半乳糖苷酶···缺陷型β-半乳糖酶+IPTG诱导的β-半乳糖苷酶α肽，两者的复合物能降解培养基中的x-gal产生蓝色物质。

问题：
因为原核生物内不存在修饰因此可能存在真核DNA不表达的情况。
有的时候表达出的肽链由于缺少分子伴侣或者相关修饰，可能不溶。
小蛋白可以用过变性复性的方法进行溶解
解决方法用真核、昆虫、甚至哺乳细胞作为宿主

CRISPR-cas

获得性免疫系统

All you need is：Gene-edit and CRISPR